本发明公开了一种花
1.一种花ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="66"/>精子超低温冷冻保存和复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：xa0(1)亲本选择：选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的花xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="73"/>雄鱼作为亲本，xa0(2)取精：对性成熟的雄鱼注射催产剂，在水温16-18℃环境中暂养16-20h后，轻压鱼腹，取精液；xa0(3)冷冻：将精液与稀释液按1:2-3的体积比混合均匀，2-4℃下平衡20-30min后，加入抗冻剂DMSO混匀得混合精液，分装至离心管中，置于液氮液面上方4-7cm处平衡15-20min，然后再置于液氮液面上平衡5-8min，再放入液氮中保存；xa0(4)复苏：从液氮中取出装有精液的离心管，置于液氮蒸汽中平衡5-10min，然后迅速置于37±1℃水浴中快速晃动至融化得解冻精液；xa0(5)人工授精：将解冻精液与花ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="66"/>鱼卵混合进行人工授精；xa0所述催产剂由绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成，每千克体重的鱼催产剂注射量为：绒毛膜促性腺激素500-750IU，促黄体素释放激素A₂xa04-6微克，马来酸地欧酮2-3毫克；所述稀释液的配方为：氯化纳1.0-1.5wt％、氯化钾0.05-0.1wt％、葡萄糖1-2wt％，余量为水；所述混合精液中抗冻剂DMSO占的体积百分比为6-8％；人工授精是将解冻精液与花ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="63"/>鱼卵搅拌混匀后，加入泥浆水中，继续搅拌10-60秒，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器中孵化；解冻精液与花ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="67"/>鱼卵用量为每300ml鱼卵加10-15ml解冻精液；泥浆水的体积为花ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="66"/>鱼卵体积的3-5倍。xa0技术领域
本发明涉及一种鱼类精子的保存及复苏方法，特别涉及一种花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>精子超低温冷冻保存和复苏方法。
背景技术
花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>（Hemibarbusxa0maculates）俗称麻鲤、麻花鱼、杨花鱼、季郎鱼等。是湖泊、河流中常见的一种中小型经济鱼类。因其肉质细嫩，味道鲜美，营养价值高等特点，深受广大消费者的青睐，2001年突破花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="61"/>的人工繁殖技术以来，已成为淡水养殖新品种之一。近年来，因环境污染不断加剧，加上鱼类资源的过度捕捞，太湖野生花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="58"/>资源不断减少，野生种质严重退化，因此，对其进行精子超低温冷冻保存技术的研究对于花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>优良品种的种质资源保护及遗传多样性保护具有重要意义。CN100569071C的发明公开了一种中华鲟精子超低温冷冻保存的方法，包括精子采集，镜检，精子稀释，加抗冻剂分装及液氮保存等步骤，但其不适合于花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="61"/>精子的保存。
发明内容
本发明的目的在于提供一种花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>精子超低温冷冻保存和复苏方法，具有操作时间短、成本低、操作方便、保存时间长、损伤程度小、复苏后精子成活率较高等优点，对于花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>优良品种的种质资源保护及遗传多样性保护具有重要意义。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="58"/>精子超低温冷冻保存和复苏方法，包括以下步骤：（1）亲本选择：选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="58"/>雄鱼作为亲本，（2）取精：对性成熟的雄鱼注射催产剂，在水温16-18℃环境中暂养16-20h后，轻压鱼腹，取精液；（3）冷冻：将精液与稀释液按1:2-3的体积比混合均匀，2-4℃下平衡20-30min后，加入抗冻剂DMSO混匀得混合精液，分装至离心管中，置于液氮液面上方4-7cm处平衡15-20min，然后再置于液氮液面上平衡5-8min，再放入液氮中保存；（4）复苏：从液氮中取出装有精液的离心管，置于液氮蒸汽中平衡5-10min，然后迅速置于37±1℃水浴中快速晃动至融化得解冻精液；（5）人工授精：将解冻精液与花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>鱼卵混合进行人工授精。本发明针对花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="57"/>的生物特性，配制特定的催产剂（绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成），促使雄鱼快速高效产精，然后配制稀释液稀释后，加入抗冻剂，开发了精子保存时间长、损伤程度小、复苏后精子成活率较高的冷冻保存及复苏方法，设计了有效的人工授精方法，对于花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="58"/>优良品种的种质资源的保存具有重要意义。作为优选，所述催产剂由绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成，每千克体重的鱼催产剂注射量为：绒毛膜促性腺激素500-750xa0IU，促黄体素释放激素A₂xa04-6微克，马来酸地欧酮2-3毫克。控制各催产剂组分的用量促使雄鱼快速高效产精效果好。作为优选，所述稀释液的配方为：氯化纳1.0-1.5wt%、氯化钾0.05-0.1wt%、葡萄糖1-2wt%，余量为水。稀释液是针对花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>精液的渗透压进行特定配制的，对精子的保存效果好。作为优选，所述混合精液中抗冻剂DMSO占的体积百分比为6-8%。这样抗冻效果好。作为优选，人工授精是将解冻精液与花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>鱼卵搅拌混匀后，加入泥浆水中，继续搅拌10-60秒，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器中孵化。作为优选，解冻精液与花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="58"/>鱼卵用量为每300ml鱼卵加10-15ml解冻精液。作为优选，泥浆水的体积为花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>鱼卵体积的3-5倍。这样受精成功率高。本发明的有益效果是：具有操作时间短、成本低、操作方便、保存时间长、损伤程度小、复苏后精子成活率较高等优点，在花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="56"/>的种质保存、遗传育种、可持续养殖及病害防治等方面有着重要的理论意义和应用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。绒毛膜促性腺激素（HCG，市售，宁波市三生药业有限公司），促黄体素释放激素A₂（LHRH-A₂，市售，宁波市三生药业有限公司），马来酸地欧酮（DOM，市售，宁波市三生药业有限公司）。花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>来源为太湖捕获的野生花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>。实施例1：（1）亲本选择：选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="57"/>雄鱼作为亲本。（2）取精：在花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>的繁殖期对性成熟的雄鱼注射催产剂，在水温16℃环境中暂养20h后，轻压鱼腹，用干净医用注射器获取无血污、无尿污的精液，先用塑料细口吸管吸一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅匀，观察其活力，鲜精活力在90%以上的精液样品用于精子冷冻保存。催产剂由绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成，每千克体重的鱼催产剂注射量为：绒毛膜促性腺激素500xa0IU，促黄体素释放激素A₂xa06微克，马来酸地欧酮3毫克。（3）冷冻：将23.5ml精液与70.5ml稀释液混合均匀，2℃下平衡20min后，加入6ml抗冻剂DMSO（市售）混匀得混合精液，分装至1.5ml离心管中，置于液氮液面上方4cm处平衡15min，然后再置于液氮液面上平衡5min，再放入液氮中保存。稀释液的配方为：氯化纳1.0wt%、氯化钾0.1wt%、葡萄糖2wt%，余量为水。（4）复苏：从液氮中取出装有精液的离心管，置于液氮蒸汽中平衡5min，然后迅速置于37±1℃水浴中快速晃动至融化得解冻精液。（5）人工授精：将解冻精液与花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>鱼卵（每300ml鱼卵加10ml解冻精液）搅拌混匀后，加入泥浆水中，泥浆水的体积约为花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>鱼卵体积的3倍，继续搅拌10秒，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器中孵化。实施例2：（1）亲本选择：选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>雄鱼作为亲本。（2）取精：在花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>的繁殖期对性成熟的雄鱼注射催产剂，在水温18℃环境中暂养16h后，轻压鱼腹，用干净医用注射器获取无血污、无尿污的精液，先用塑料细口吸管吸一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅匀，观察其活力，鲜精活力在90%以上的精液样品用于精子冷冻保存。催产剂由绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成，每千克体重的鱼催产剂注射量为：绒毛膜促性腺激素750xa0IU，促黄体素释放激素A₂xa04微克，马来酸地欧酮2毫克。（3）冷冻：将30ml精液与62ml稀释液混合均匀，4℃下平衡30min后，加入8ml抗冻剂DMSO混匀得混合精液，分装至1.5ml离心管中，置于液氮液面上方7cm处平衡20min，然后再置于液氮液面上平衡8min，再放入液氮中保存。稀释液的配方为：氯化纳1.5wt%、氯化钾0.05wt%、葡萄糖1wt%，余量为水。（4）复苏：从液氮中取出装有精液的离心管，置于液氮蒸汽中平衡10min，然后迅速置于37±1℃水浴中快速晃动至融化得解冻精液。（5）人工授精：将解冻精液与花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>鱼卵（每300ml鱼卵加15ml解冻精液）搅拌混匀后，加入泥浆水中，泥浆水的体积约为花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>鱼卵体积的5倍，继续搅拌60秒，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器中孵化。实施例3：（1）亲本选择：选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>雄鱼作为亲本。（2）取精：在花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="58"/>的繁殖期对性成熟的雄鱼注射催产剂，在水温17℃环境中暂养16h后，轻压鱼腹，用干净医用注射器获取无血污、无尿污的精液，先用塑料细口吸管吸一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅匀，观察其活力，鲜精活力在90%以上的精液样品用于精子冷冻保存。催产剂由绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成，每千克体重的鱼催产剂注射量为：绒毛膜促性腺激素500xa0IU，促黄体素释放激素A₂xa05微克，马来酸地欧酮2毫克。（3）冷冻：将31ml精液与62ml稀释液混合均匀，4℃下平衡30min后，加入7ml抗冻剂DMSO混匀得混合精液，分装至1.5ml离心管中，置于液氮液面上方5cm处平衡15min，然后再置于液氮液面上平衡5min，再放入液氮中保存。稀释液的配方为：氯化纳1.0wt%、氯化钾0.05wt%、葡萄糖1.5wt%，余量为水。（4）复苏：从液氮中取出装有精液的离心管，置于液氮蒸汽中平衡5min，然后迅速置于37±1℃水浴中快速晃动至融化得解冻精液。（5）人工授精：将解冻精液与花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="59"/>鱼卵（每300ml鱼卵加12ml解冻精液）搅拌混匀后，加入泥浆水中，泥浆水的体积约为花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>鱼卵体积的4倍，继续搅拌30秒，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器中孵化。冻精活力检测先用塑料细口吸管吸一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取解冻精液立即于显微镜下搅匀，观察其活力，经检测精子存活率平均为75.6%。人工授精具体实施2013年4月24日，进行复苏精液人工授精实验。将花ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="60"/>鱼卵挤入干燥的碗中，共挤卵250ml（约132000粒），滴加约9ml解冻精液并拌匀后倒入1000ml的泥浆水中，继续搅拌约1分钟，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器孵化。受精率平均为79.2%，孵化率平均为76.5%。2013年4月28日共计孵化出约80000尾鱼苗。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。